Интерфероны на борьбу с вирусами: история открытия и развития

Вирусы – уникальные микроорганизмы, которые, находя брешь в иммунной системе, способны встраиваться в клетки организма, мутировать и нарушать его жизнедеятельность, доставляя немало дискомфорта.

Большинство из нас название «вирус» связывают с респираторными заболеваниями. Однако известны вирусы, которые поражают и гепатобилиарную, и нервную, и пищеварительную системы, и разновидностей таких микроорганизмов – огромное множество. На протяжении многих лет человечество искало способ универсальной защиты для организма от различных видов вирусов. И ровно 61 год назад, в 1957 году, благодаря стараниям ученых А. Айзекса (A. Isaacs) и Ж. Линденманна (J. Lindenmann) было сделано величайшее открытие – идентифицированы и описаны вещества с мощными противовирусными свойствами, относящиеся к первой линии защиты организма – интерфероны.

У истоков открытия

Но вернемся на пару десятков лет назад. Еще    в 1935 г. американский исследователь М. Хоскинс (М. Hoskins) обнаружил, что обезьяна, зараженная вирусом желтой лихорадки нейротропного типа, становится невосприимчивой к вирусу желтой лихорадки, поражающему внутренние органы. Ученый полагал, что это происходит вследствие соединения действия обоих вирусов и поэтому назвал открытое им явление интерференцией вирусов. Два года спустя после его опытов английские ученые Г. Финдлей (G. Findley) и Ф. Маккаллум (F. MacCallum) показали, что следствием заражения вирусом желтой лихорадки является невосприимчивость к вирусам не только желтой лихорадки, но и к вирусам, генетически отличающимся от него. Таким образом, стало очевидным, что имеется механизм защиты от вирусов, не связанный с выработкой антител против перенесенной инфекции.

Однако и после этого природа данного феномена (интерференции вирусов) долго оставалась невыясненной.

В поисках ответа на данный вопрос ученые Айзекс и Линденманн, на тот момент сотрудники Национального института медицинских исследований (National Institute for Medical Research), предприняли попытку объяснить феномен вирусной интерференции.

Вечером 6 ноября 1956 г. английский вирусолог Алик Айзекс, занимавшийся изучением феномена вирусной интерференции, записал в своем блокноте необычную фразу: «в поисках интерферона». Этим шутливым словом, придуманным швейцарским ученым Жаном Линденманном, соавтором открытия эндогенного фактора противовирусной защиты, начинается первая глава в истории изучения и клинического применения основного противовирусного средства современности.

 

Чудодейственный «флюид»

Лабораторная модель, предложенная Айзексом и Линденманном, была проста и элегантна. Инактивированный вирус гриппа вводили в оболочку эмбриона цыпленка, вызывая тем самым образование особого вещества, до этого неизвестного. Ученые лишь догадывались о его существовании, а потому поначалу назвали «флюидом». После введения полученного «флюида» в свежую, ранее не инфицированную оболочку дальнейшие попытки заражения эмбриона вирусом гриппа (даже не ослабленным!) были безуспешными. Эмбрионы становились неуязвимыми! Впоследствии оказалось, что чудодейственным «флюидом» и был интерферон. На все исследования ученым понадобилось меньше года.

В 1957 г. в журнале «Proceedings of the Royal Society» Алик Айзекс и Жан Линденманн опубликовали две статьи, посвященные открытию и изучению белка интерферона (ИФН). Авторы описывали ИФН как «белок, значительно меньший, чем иммуноглобулины, который производится клетками различных видов животных после заражения живыми или инактивированными вирусами; способный ингибировать рост разнообразных вирусов в клетках тех же видов животных, в дозах, нетоксичных для клеток». Эти работы открыли эру ИФН. Благодаря этому человечество обрело мощное естественное средство в борьбе с вирусными инфекциями.

Важность открытия подтверждается тем, что уже в 1959 г. для координации научной программы исследований был образован Научный комитет по интерферону (далее – Комитет), который возглавил Алик Айзекс. Комитет сфокусировал свои задачи на развитии методов продукции ИФН и его очистки. В первую очередь Комитет сосредоточился на проблеме видоспецифичности в связи с необходимостью получения препарата ИФН, который мог бы использоваться в лечении человека. Из соображений видового сходства приматов первое испытание на добровольцах было предпринято с ИФН, полученным на клетках обезьян. В июне 1960 г. Д. А. Тиррелл информировал Комитет о проведении эксперимента с обезьяньим ИФН на добровольцах из числа сотрудников своей лаборатории. За несколько дней до заседания Комитета сам Тиррелл, а также отдельные члены комитета ввели себе интраназально небольшое количество обезьяньего ИФН. Непосредственно перед заседанием участников эксперимента заразили вирусом Коксаки, вызывающим простуду. Через несколько месяцев Д. А. Тиррелл доложил: несмотря на то, что в назальных смывах у всех участников эксперимента был выявлен вирус возбудителя, заболел только он один. При этом побочные эффекты действия ИФН обнаружены не были. На основании полученных данных члены Комитета одобрили проведение официальных испытаний ИФН на добровольцах. Результаты испытаний были опубликованы в журнале «Lancet» в апреле 1962 г., где был показан адъювантный эффект ИФН при вакцинации.

 

Каскад открытий

Практически все известные на тот момент вирусы погибали под воздействием интерферона. Этот универсальный агент иммунной защиты выгодно отличался от химиопрепаратов своей многофункциональностью и аутентичностью. К тому же, известно, что вирусы не чувствительны к антибиотикам. Поэтому интерферон стал первым препаратом, способным противостоять именно вирусам.

Так в середине 60-х годов прошлого века появилось первое поколение медицинских интерферонов.

Например, ювенильный папилломатоз гортани – заболевание вирусной этиологии, которое проявлялось доброкачественными образованиями в области голосовых связок, но угрожало пациенту смертью от удушья, – до открытия интерферона лечили исключительно операционным путем. Однако вирус проявлял себя все новыми гибельными новообразованиями на слизистой, поэтому число операций, которые доводилось переносить пациентам (в основном детям), исчислялось десятками. Терапия интерфероном решала эту проблему раз и навсегда – в большинстве случаев возбудитель погибал окончательно.

Спустя некоторое время после открытия и успешных клинических испытаний интерферона в качестве антивирусного препарата была обнаружена еще одна его активность – противоопухолевая. Ион Грессер показал, что этот белок способен остановить пролиферацию раковых клеток у лабораторных мышей.

Грандиозный прорыв в области вирусологии и онкологии вдохновил другого ученого – финна Кари Кантелла – на эксперименты по извлечению интерферона из лейкоцитов человеческой крови.

В дальнейшем интерферон был обнаружен у всех позвоночных. И хотя его аминокислотная последовательность у разных видов живых организмов различна, интерферон проявляет антивирусную активность даже в клетках чужого вида. Однако интерферон, который, например, продуцируют клетки кролика, куда менее эффективен и полезен для нас в борьбе с инфекцией, нежели человеческий.

Эта особенность позволила сформулировать одну из первых задач, вставших перед биотехнологами: производство интерферона из человеческих лейкоцитов было слишком дорогостоящим, а использование крови животных не обещало столь же успешных результатов. Поэтому в 60–70-е годы прошлого века при получении интерферона приходилось довольствоваться донорской кровью.

 

Видовое разнообразие

За прошедшее с момента открытия ИФН время были обнаружены и изучены различные белки ИФН. В организме человека их вырабатывается около 20 видов. В начале 1960-х гг. ИФН классифицировали по клеткам-продуцентам: лейкоцитарный (ИФН-α), фибробластный (ИФН-β) и иммунный (ИФН-γ).

Рис. 1. Механизм действия интерферонов (ИФН) I типа: активация врожденного и адаптивного иммунитета.

 

На сегодняшний день ИФН подразделяют по принципу иммуногенных свойств и отличий в генных последовательностях, которые кодируют разные популяции молекул ИФН. В зависимости от этих признаков, а также от физико-химических характеристик, механизма действия и на основании ряда других факторов ИФН подразделяют на 3 типа – I, II, III. ИФН I типа (α, β, ω, ε) продуцируются и секретируются большинством клеток организма в ответ на действие вирусов и некоторых других агентов. К ИФН II типа относится ИФН-γ, который продуцируется клетками иммунной системы в ответ на действие чужеродных агентов. К III типу относится недавно открытый ИФН-λ.

С медицинской точки зрения наиболее важна противовирусная функция ИФН I типа. Механизм их действия заключается в следующем (Рис. 1). При обнаружении патогенных микроорганизмов, вирусов и бактерий инфицированные клетки производят ИФН I типа. Макрофаги и дендритные клетки, ответственные за развитие врожденного  иммунитета, производят ИФН I типа после узнавания патогенных компонентов с использованием различных рецепторов (PRRs), которые находятся на плазматической мембране, в эндосомах и по всей цитоплазме. В частности, плазмоцитоидные дендритные клетки производят большое количество ИФН-α. Неимунные клетки, такие как фибробласты и эпителиальные клетки, преимущественно производят ИФН-β. В инфицированных и соседних клетках ИФН I типа индуцируют экспрессию ИФН-стимулированных генов (ISGs), продукты которых инициируют внутриклеточную антимикробную программу. Запущенный механизм ограничивает распространение инфекционных агентов. Дендритные клетки и макрофаги при воздействии ИФН I типа усиливают презентацию антигенов и выработку иммунных медиаторов, например, цитокинов и хемокинов. ИФН I типа могут увеличить выработку антител В-клетками и усиливают эффекторную функцию Т-клеток. PAMP – патогенассоциированные молекулярные паттерны (образы); PRR – патоген-распознающие рецепторы; ISGs – ИФНстимулированные гены.

 

В промышленных масштабах

Перед тем, как начать широкомасштабное производство препаратов интерферона, необходимо было провести полноценные клинические испытания. Для этого было чрезвычайно важно, чтобы дозировка используемых препаратов была сопоставима. Таким образом, возникла необходимость создать международные стандарты ИФН. Национальные референсные образцы человеческого лейкоцитарного ИФН были разработаны к 1969 г. в Национальном институте биологических стандартов и контроля (Великобритания), Национальном институте аллергии и инфекционных заболеваний (США) и Государственном научно-исследовательском институте стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А.Тарасевича.

В 1978 г. ВОЗ выпустила меморандум, обобщивший накопленный мировой опыт по производству, контролю качества и клиническому применению ИФН. В меморандуме было сформулировано требование о необходимости стандартизации препаратов ИФН.

Разработкой международных стандартов занялись 93 лаборатории из 29 стран мира. 15 различных препаратов ИФН-α были исследованы на противовирусную и антипролиферативную активность.

Полученные результаты представили в NIBSC для обобщения и сравнения. Поскольку самым важным тестом для характеристики всех ИФН является определение их противовирусной активности, для ее сравнения в 1999 г. на 50-й сессии Экспертного комитета по биологической стандартизации ВОЗ (The WHO Expert Committee on Biological Standardization, ECBS) был принят первый международный референспрепарат биологической активности (1st International Reference Preparation, IRP). Одна ампула стандарта IRP содержала человеческий лейкоцитарный ИФН с суммарной активностью 11 000 международных единиц (ME). На той же сессии были приняты стандарты и для других ИФН, в том числе человеческого рекомбинантного ИФН альфа-2b [Interferon alpha-2b, human, recombinant, rHulFNalpha2 (alpha-2b)] с активностью 70 000 ME/амп. Оба референс-препарата ВОЗ хранятся в NIBSC и используются по настоящее время.

Необходимость создания двух стандартов биологической активности ИФН была продиктована тем, что к этому времени помимо природных лейкоцитарных ИФН были разработаны препараты на основе рекомбинантных технологий.

 

Рекомбинантный интерферон: новые возможности терапии и профилактики

Следует  отметить, что  препараты человеческого лейкоцитарного ИФН представляют совокупность ИФН-α, а также других белков-цитокинов, синтезируемых лейкоцитами донорской крови в ответ на воздействие вируса-интерфероногена. Это объясняет его высокую клиническую эффективность.

Однако при этом состав препарата человеческого лейкоцитарного ИФН непостоянен даже у одного производителя. К недостаткам препаратов ИФН, полученных из крови человека, помимо неоднородности состава, относится также низкая степень очистки, в том числе от вирусных частиц – индукторов синтеза ИФН. Кроме того, нельзя не отметить высокую себестоимость таких препаратов и невозможность их парентерального применения.

При этом отличительной особенностью рекомбинантных интерферонов является то, что они получены вне организма человека (продуцируются бактерией E. coli, в ДНК которой встроен ген человеческого интерферона). Это значительно удешевляет производство, а также сводит к нулю вероятность передачи какой-либо инфекции от донора.

Получение методами генной инженерии препаратов человеческого ИФН-α в бактериальных клетках позволило преодолеть все вышеназванные проблемы и получать особо чистый однородный рекомбинантный белок ИФН, идентичный природному по аминокислотному составу, в больших количествах и по относительно низкой себестоимости.

 

По  материалам:  dommedika.com, www.ru-med.com.ua,  firnm.ru, dic.academic.ru