Иммуноферментный анализ как способ найти то, что скрыто от посторонних глаз.

В настоящее время современная медицина не представляется возможной без высокочувствительных лабораторных анализов. И если ранее доктору нужно было определенное время для подтверждения своих догадок относительно вопроса присутствия того или иного возбудителя, паразитирующего в организме пациента, то сейчас достаточно всего нескольких часов и одного точного анализа, чтобы выявить истинную причину ухудшения состояния здоровья. Именно таким методом лабораторной диагностики является иммуноферментный анализ.


Иммуноферментный анализ (ИФА) — метод лабораторной диагностики, основанный на проведении реакции «антиген-антитело», которая позволяет определить наличие определенных веществ белковой природы (в том числе ферменты, вирусы, фрагменты бактерий и другие компоненты биологических жидкостей).


Первоначально, чтобы понимать насколько хорош в профессиональном плане данный метод исследования, и почему он так важен, следует разобраться в том что же представляет собой реакция «антиген – антитело».

АНТИГЕН — это чужеродная для организма молекула белкового происхождения, которая попадает в тело человека вместе с инфекционным агентом или продуктами его жизнедеятельности. Однако, например, форменные элементы  крови другого человека (если она не совпадает с нашей кровью по группе) также являются антигенами. В организме антигены вызывают иммунную реакцию, направленную на защиту целостности внутренней среды от чужеродных веществ. Для этого наше тело синтезирует особые вещества — антитела (иммуноглобулины), способные по принципу «ключ - замок» соединяться с антигенами, связывая их в иммунный комплекс (этот процесс как раз называется реакцией «антиген-антитело»). Такие иммунные комплексы проще распознаются организмом и уничтожаются клетками иммунитета.

 Существуют определенные этапы выработки и разновидности антител, каждая из которых вступает в действие на определенном этапе иммунного ответа. Так, первыми в ответ на попадание антигена в организм человека синтезируются иммуноглобулины класса М (IgM). Соответственно, содержание этих антител наиболее высоко в первые дни инфекционного процесса.

Следующим классом иммуноглобулинов, которые синтезирует иммунная система являются антитела класса G (IgG), которые помогают полностья устраненить инфекцию, а также продолжают циркулировать в общем кровотоке, обеспечивая иммунитет к повторному заражению. Именно на данном этапе синтеза иммуноглобулинов и основан метод вакцинации: благодаря которому, а конкретно препаратам содержащим ослабленные антигены микробов и вирусов, в нашей крови появляется большое количество IgG, которые при контакте с реальной угрозой в виде микроорганизмов  быстро подавляют инфекцию еще до того, как она нанесет вред нашему здоровью.

Также в организме синтезируются иммуноглобулины класса А. Они в большом количестве содержатся на поверхности слизистых оболочек, обеспечивая так называемый щит на подступах к организму человека. Еще одним классом являются иммуноглобулины класса Е, которые обеспечивают защиту от паразитарных инфекций. 

В лабораторной диагностике объектами интереса чаще всего являются IgM, IgG и IgA: по их концентрации можно оценить, на какой стадии находится инфекционный процесс, а также определить, болел ли когда-либо человек тем или иным недугом.

И как определить, какие именно антигены и антитела в данный момент присутствуют в организме человека? Когда врач заподозрил,  что в организме пациента циркулирует определенный инфекционный возбудитель, или же существуют показания для измерения уровня определенного гормона, то именно в таких случаях пациенту назначают иммуноферментный анализ. Для начала у пациента берут образец биологической жидкости.

Основной биоматериал для проведения ИФА — это сыворотка крови. В лаборатории у пациента берут образец крови из вены, из которого в дальнейшем удаляют форменные элементы, мешающие проведению анализа. В некоторых других случаях для анализа используется спинномозговая жидкость, околоплодные воды, мазки слизистых оболочек и т.д. Для того чтобы избежать искажений в результатах, рекомендуется сдавать кровь натощак, а за две недели до исследования (если целью является диагностика хронических, скрыто протекающих инфекционных заболеваний) необходимо отказаться от приема антибиотиков и противовирусных препаратов. Лаборатория использует пластиковые планшеты с лунками, в которых на момент исследования уже содержатся очищенные антигены предполагаемого возбудителя (или — антитела, в случае если задачей является выявление и поиск антигена). Образцы вносятся в лунки, где происходит — или не происходит — образование иммунных комплексов. Если реакция состоялась, красящее вещество вступает в ферментную реакцию с образовавшимся комплексом, что позволяет с помощью инструментальной оценки оптической плотности сделать выводы о результатах анализа

Иммуноферментный анализ в свою очередь подразделяется на качественный и количественный. В случае качественного анализа подразумевается более общий ответ: искомое вещество или найдено, или не найдено в образце. В случае с количественным анализом более сложная цепь реакций дает возможность оценить концентрацию антител в крови человека, что в сравнении с результатами предыдущих произведенных тестов даст ответ на вопрос о том, как развивается инфекционный процесс.

Стоит обозначить, что предшественником иммуноферментного анализа был радиоиммунный анализ, в котором для идентификации успешной реакции использовались антитела и антигены меченые радиоактивными изотопами. Поскольку проведение такой диагностики представляло потенциальную угрозу для здоровья сотрудников исследовательских лаборатории, ученые занялись поиском более безопасного, и не менее действенного альтернативного диагностического метода.  В середине 60-х годов для идентификации и локализации антигенов в гистохимических препаратах и выявления полос преципитации в иммунодиффузионных и иммуноэлектрофоретических методах в качестве высокочувствительной метки было предложено использовать молекулы ферментов. Являясь мощными химическими катализаторами, ферменты способны эффективно вырабатывать легко определяемые вещества, что делает возможным определение ферментной метки в весьма малых концентрациях. На протяжении последних двух десятилетий иммуноферментные методы анализа интенсивно развивались как в теоретическом, так и практическом плане и к настоящему времени они сформировались в самостоятельное научное направление, имеющее важное прикладное значение. Использование твердых носителей для выделения антител с последующим специфическим связыванием анализируемого соединения и выявлением образовавшихся иммунных комплексов с помощью меченных ферментами компонентов положило начало методам твердофазного иммуноферментного анализа. Впервые такой анализ произвели в 1971 году Е. Энгвал и П. Перлман для детекции IgG фракции иммуноглобулинов, К. Ван Веемен и А. Шурс для обнаружения эстрогенов. Так, по определению 1971 год является годом открытия иммуноферментного анализа.

Явными преимуществами иммуноферментного анализа является высокая чувствительность и специфичность метода. Чувствительность подразумевает под собой возможность распознать искомое вещество, даже если его концентрация в образце минимальна. Специфичность же является критерием безошибочности диагностики: если результат положительный, значит, найдены именно те антитело или антиген, которые предполагались, и ни какие другие. ИФА во многом заменил «золотой метод» лабораторной диагностики — бактериологический метод исследования, при применении кторого для идентификации возбудителя требовалось выделить его из организма, а затем в течение определенного времени (как правило, нескольких дней) выращивать культуру на питательной среде. Все то время, пока производился анализ, врачи были вынуждены  проводить лечение пациента «вслепую», догадываясь о происхождении микроорганизма исключительно по симптомам болезни. Определение иммуноглобулина М (IgM) с помощью ИФА сейчас позволяет поставить точный диагноз уже в первые дни болезни. Высокая степень точности и технологичности иммуноферментного анализа минимизирует вмешательство человеческого фактора, что снижает вероятность ошибки. Большинство используемых в современных лабораториях тест-систем и реактивов для ИФА выпускаются в условиях специализированных производства, что гарантирует точный результат.

Но, к сожалению, как и любое лабораторное исследование, иммуноферментный анализ обладает определенным спектром недостатков. Для проведения ИФА нужно точно знать, для чего именно проводиться исследование и что именно мы ищем. Исследование подразумевает, что доктор заранее должен предполагать определенную природу заболевания. В случае диагностики инфекционных заболеваний иммуноферментный анализ не может определить возбудителя и найти его специфичные свойства: он лишь указывает на наличие антител в крови у больного, косвенно свидетельствующих о присутствии чужеродного микроорганизма в теле человека. Стоит также заметить, что иммуноферментный анализ не является дешевым, поэтому при назначении данного исследования нужно руководствоваться его целесообразностью в тех или иных случаях.

Определение содержание в крови такого класса иммуноглобулинов как G и M (IgG, IgM) позволяет диагностировать следующий перечень заболеваний: вирусные гепатиты А, B, C, E, цитомегаловирусная инфекция, вирус Эпштейна – Барра, токсоплазмоз, корь, краснуха, сальмонеллез, дизентерия, клещевой энцефалит  и многие другие. Также ИФА помогает получить общую оценку показателей иммунитета человека и маркеров некоторых аутоиммунных заболеваний и онкологических заболеваний (фактора некроза опухоли, простатспецифического антигена, раково-эмбрионального антигена и других), а также определить содержания гормонов в сыворотке крови (прогестерона, пролактина, тестостерона, тиреотропного гормона и других). Обычно результатов иммуноферментного анализа не приходится ждать длительное время. Расшифровка происходит за достаточно короткое время, в среднем для предоставления результатов лечащему врачу необходимо не более 24 часов. В случае экстренной госпитализации, либо же в ситуации явной угрозы жизни пациенту, данный метод исследования возможно провести за несколько часов.

Расшифровкой ИФА, как правило, занимаются лечащие врачи. Результатом качественно проведенного исследования является только один исход: искомый комплекс либо обнаружен в организме пациента, либо нет. Если же  идет о количественном анализе, то концентрация может выражаться числовым значением или определенным количеством знаков «+» (от одного до нескольких). Как правило, анализируемые показатели могут иметь следующие результаты: 

1. IgM — наличие этого класса иммуноглобулинов говорит об остром инфекционном процессе в организме. Отсутствие IgM может говорить как об отсутствии конкретного возбудителя в организме, так и о переходе инфекции в хроническую стадию. 

2. IgA при отрицательном результате теста на IgM чаще всего свидетельствует о хронической или скрыто протекающей инфекции. 

3. IgM и IgA (одновременно совместное присутствие) — два положительных результата говорят о разгаре острой фазы заболевания.

4. IgG говорит либо о переходе заболевания в хроническое течение, либо о выздоровлении и выработке иммунитета к инфекционному агенту.

Еще один количественный показатель — индекс авидности антител, выраженный в процентах. Он указывает, сколько времени прошло от начала инфекционного процесса (чем выше индекс — тем больше).


В заключение хотелось бы сказать, что в современном мире трудно переоценить важность иммуноферментного анализа. С его помощью любой, даже не самый опытный врач, способен достоверно выявить заподозренный инфекционный процесс, и назначить адекватную и прицельную терапию для эффективного лечения заболевания. Но в тоже время следует понимать, что такие дорогостоящие исследования нужно назначать с умом и определенной целесообразностью, дабы оправдать потраченные на него средства.

 

Кислов Александр, сотрудник кафедры биохимии ХНМУ